Revista Asma 2017-02-01

Crespo-Lessmann A. Rev Asma. 2017;2(2):153-158

Métodos no invasivos para identificar el fenotipo inflamatorio del asma

Autora

Astrid Crespo-Lessmann

Servicio de Neumología, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Institut d’Investigació Biomèdica Sant Pau. Barcelona, España

Correspondencia

Astrid Crespo Lessmann
Servicio de Neumología. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau
C/ Mas Casanovas, 90. 08041 Barcelona, España
Tel: +34-93 556 59 72. Fax: +34 93 556 56 01
E-mail: acrespo@santpau.cat

 

Resumen

Aproximadamente un 10% de los asmáticos sufren una enfermedad grave o refractaria a los tratamientos disponibles en la actualidad. El desarrollo de nuevos métodos que sirvan como herramientas para medir la inflamación bronquial puede permitir en estos pacientes una terapia más individualizada. Entre los métodos no invasivos para medir la inflamación de la vía aérea usados en la práctica clínica figuran el recuento de células inflamatorias en el esputo inducido y la fracción exhalada de óxido nítrico (FeNO). La temperatura del aire exhalado, el condensado del aire exhalado y la nariz electrónica se plantean como nuevas herramientas de medición de la inflamación bronquial y del control del asma, pero actualmente solo tienen utilidad en el campo de la investigación.

En esta revisión aportaré de forma resumida, y basada en las publicaciones más relevantes, una visión actualizada y objetiva de los diversos métodos no invasivos utilizados para identificar los fenotipos inflamatorios del asma.

Introducción

Las guías de práctica clínica en asma1-3 recomiendan la determinación de la inflamación bronquial en los pacientes con asma grave no controlada.

La forma más directa de medir la inflamación bronquial es con una biopsia bronquial. Sin embargo, al tratarse de un método invasivo, su utilidad se limita a los ensayos clínicos o en ocasiones excepcionales a pacientes asmáticos que requieran una indicación de esta prueba. El uso de biomarcadores como la medición en sangre del recuento de eosinófilos, de los niveles de IgE total o de periostina en suero constituye otra línea en desarrollo utilizada cada vez más en la práctica clínica4.

En los últimos años ha aumentado el interés en el descubrimiento de nuevos métodos que permitan valorar de una forma no invasiva la inflamación de la vía aérea. Algunos han sido utilizados en la práctica clínica diaria y han aportado un mejor manejo en el uso de tratamientos para el asma5-6. Dentro de los métodos no invasivos de que disponemos para evaluar la inflamación de la vía aérea tenemos el esputo inducido, la fracción exhalada de óxido nítrico, el condensado del aire exhalado, la temperatura del aire exhalado y, más recientemente, la nariz electrónica.

Métodos no invasivos para medir la inflamación bronquial

ESPUTO INDUCIDO

El recuento de células inflamatorias en el esputo inducido (EI) sigue siendo la exploración no invasiva más eficaz para valorar la inflamación bronquial y la herramienta más valiosa para predecir respuestas terapéuticas. El EI puede ser útil: en el diagnóstico diferencial del asma, en asmáticos con mala evolución de su enfermedad a pesar del tratamiento glucocorticoideo, en la prevención de exacerbaciones eosinofílicas asmáticas, en el estudio del solapamiento de asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), en el estudio del asma ocupacional, en el manejo de la tos crónica, en el estudio por sospecha de microaspiraciones, en pacientes con asma que cursan con disociación clínica-FeNO, en la clasificación del asma por fenotipos inflamatorios bronquiales y en el estudio del asma grave no controlada.

Método, procesado y valores de referencia del esputo inducido

El método y el procesado del EI están estandarizados y publicados por la European Respiratory Society en un suplemento especial del año 20027. Este suplemento se compone de diversas partes que incluyen la obtención de la muestra del EI y su seguridad8, el método del procesado del recuento celular e inmunohistoquímica9, el análisis de los mediadores de las fracciones líquida y celular10, las aplicaciones clínicas11, el empleo del EI en el ámbito pediátrico12, el uso del EI en los ensayos clínicos multicéntricos13 y las futuras directrices del EI14.

La inducción del esputo se realiza con soluciones salinas hipertónicas (a dosis incrementales) utilizando un nebulizador ultrasónico. Tras esta inducción se obtiene un esputo en donde el técnico selecciona los tapones de moco manualmente, los diluye con PBS de Dulbecco y añade un agente reductor “ditiotreitol” (DTT) Sputolysin®. La solución obtenida se filtra a través de un filtro de red de nailon de 41 μm de poro (Millipore), se homogeneiza y se divide en dos partes de igual volumen. Posteriormente, mediante un hemocitómetro de Neubauer se realiza el recuento de células totales y, a través de un microscopio de luz y usando tinción con azul de tripano, se determina la viabilidad celular. Después de centrifugar la preparación de células, se obtienen dos partes analizables: el sedimento celular y el sobrenadante. El sobrenadante puede ser utilizado como muestra biológica para investigar marcadores solubles de inflamación (interleuquinas, triptasa, mieloperoxidasas, proteína catiónica eosinofílica, marcadores por inmunohistoquímica, hibridación in situ o citometría de flujo), y el sedimento celular es el que actualmente se ha consolidado como aplicación clínica y el que permite clasificar al asma en fenotipos inflamatorios. Del sedimento celular se pueden realizar tres mediciones: el recuento celular total, el recuento diferencial celular y la viabilidad celular. Del recuento celular total se obtiene la concentración celular total por gramo de esputo procesado, el porcentaje de células epiteliales (que determinan la contaminación de la muestra) y la viabilidad celular (que expresa el porcentaje de células vivas por muestra analizada); estos deben ser reportados para poder así interpretar de una forma correcta los resultados15. El recuento diferencial es el que permite cuantificar la proporción de eosinófilos, neutrófilos, basófilos, macrófagos, linfocitos y células epiteliales bronquiales que se utilizarán para la interpretación del EI.

Los valores de referencia para el recuento celular total y diferencial del EI se establecieron en diversos estudios realizados en voluntarios sanos en los años noventa6,16-19. La Tabla 1 muestra los valores de referencia del recuento celular leucocitario y de otras células analizables en el EI.

Tabla 1.
Valores de referencia del recuento celular leucocitario y de otras células analizables en el esputo inducido16

Células

Valores de referencia

Eosinófilos

< 1%*

Neutrófilos

< 61-64,4%

Linfocitos

< 2,6%

Macrófagos

< 86%

Lipófagos

< 15%

Hemosiderófagos

< 2%

* eosinofilia = valor superior al 3%.

Para interpretar los valores del EI hay que tener en cuenta la calidad de la muestra, que viene definida por la viabilidad, el porcentaje de células epiteliales o el número de células totales analizadas. No existe un protocolo de estandarización de la calidad de la muestra; solo se han establecido diversos valores que indican cuándo se considera que hay contaminación por células epiteliales y cuándo se considera que existe una buena viabilidad celular o un contaje total de células mínimo para poder analizar la muestra10,16,20. Por ello es recomendable que cada laboratorio establezca un protocolo de calidad de la muestra para dar una mayor fiabilidad a la interpretación clínica del recuento celular del EI. La Tabla 2 muestra los niveles de calidad de la muestra de EI utilizados en el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona.

Tabla 2.
Niveles de calidad de la muestra del esputo inducido utilizados en el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau (Barcelona)

Nivel de calidad de la muestra de EI

Valores de referencia

Alta

Si existe una viabilidad superior al 40% y un porcentaje de células epiteliales inferior al 20%

Media

Si existe una viabilidad inferior al 40% o un porcentaje de células epiteliales superior al 20%

Baja

Si existe una viabilidad inferior al 40% y un porcentaje de células epiteliales superior al 20% o un recuento celular inferior a 1.000.000 céls./g

Al interpretar el recuento celular del EI hay que saber que la presencia de eosinófilos elevados puede indicar la necesidad de incrementar el tratamiento glucocorticoideo en pacientes con asma, predecir exacerbaciones asmáticas, ayudar en el diagnóstico de bronquitis eosinofílica o indicar una exposición a aeroalérgenos. La presencia de neutrófilos elevados en el esputo inducido puede indicar exposición tabáquica, infección respiratoria, exposición laboral a proteínas de bajo peso molecular, fibrosis pulmonar idiopática o fibrosis quística, o puede “fenotipar” a pacientes con asma grave no controlada. La combinación de neutrofilia más eosinofilia persistente puede sugerir aspergilosis broncopulmonar alérgica o una sensibilización alérgica a hongos. Un recuento de linfocitos por encima de los valores de referencia obliga a descartar sarcoidosis y otras granulomatosis, y si este valor se acompaña de un moderado incremento del recuento celular total y de neutrófilos puede ser muy sugestivo de infección vírica. La presencia de recuentos superiores al 15% de lipófagos permite sospechar microaspiraciones o reflujo gastroesofágico asociado, causa frecuente de tos crónica. La presencia de contenido antracótico en las células del esputo puede sugerir contaminación por humo o exposición al tabaco.

Dentro de las limitaciones que tiene el EI hay que mencionar la variabilidad entre las muestras debido al tipo de procesado, la variabilidad interobservador en la lectura del recuento de células, el tipo de nebulizador utilizado y el tipo de suero salino, entre otras. Asimismo, estudios recientes han observado una variabilidad del fenotipo inflamatorio del EI a lo largo del tiempo. Dicha variabilidad puede aparecer a lo largo del día21, por efecto del tratamiento con glucocorticoides inhalados (ICS)22, o a lo largo del curso evolutivo de la enfermedad, tanto en adultos23 como en niños24. En todo caso, esta variabilidad en la expresión del fenotipo inflamatorio debe cotejarse con la situación clínica de cada paciente en el momento de obtenerse la muestra, porque factores como la edad, las infecciones, el hábito tabáquico o el tiempo que transcurre entre la obtención de la muestra y su procesado, entre otros, pueden influir en la muestra.

FRACCIÓN EXHALADA DE ÓXIDO NÍTRICO

La utilidad de la medición de la fracción exhalada de óxido nítrico (FeNO) se desprende de su capacidad para reflejar inflamación bronquial, específicamente la eosinofílica. El uso de la FeNO como posible marcador de eosinofilia se basa en diversos trabajos que correlacionan la eosinofilia en la vía aérea con las mediciones de la FeNO25-27. En este sentido algunos estudios han valorado que existe una sensibilidad del 71% y una especificidad del 72% para identificar un recuento de eosinófilos superior al 3% a través de la FeNO28.

La determinación de la FeNO está estandarizada según las recomendaciones que la American Thoracic Society (ATS) y la European Respiratory Society (ERS) consensuaron en el año 200529 y por las recomendaciones del Manual de Procedimientos SEPAR n.º 1130, publicado en el año 2007.

La determinación de la FeNO es útil para el diagnóstico de la inflamación eosinofílica, la valoración de una respuesta a los glucocorticoides en pacientes con síntomas respiratorios y enfermedades crónicas, como método de monitorización de la inflamación eosinofílica bronquial y en el apoyo objetivo del diagnóstico de asma31.

La medición de la FeNO se puede realizar a través de dos sensores, de quimioluminiscencia o electroquímico, siendo este último más sencillo de utilizar y más económico, por lo que es el más empleado en los centros sanitarios.

Los rangos de normalidad de la FeNO estimados para adultos sanos suelen ser inferiores a 35 ppb. Sin embargo, existe mucha discordancia sobre qué valores límite se deben escoger para el diagnóstico de asma. Diversos metaanálisis han valorado este aspecto32-33. La GEMA1 y la ATS indican que un valor superior a 50 ppb en adultos y a 35 ppb en niños sugieren una inflamación eosinofílica y de respuesta a glucocorticoides34; en cambio, valores bajos de la FeNO (menos de 25 ppb en adultos y de 20 ppb en niños) pueden ayudar al profesional a reducir la dosis de glucocorticoides.

A la hora de interpretar los valores de la FeNO, el clínico debe tener en cuenta que existen muchos factores que pueden alterar los resultados, como por ejemplo la atopia, la edad, el sexo, el tabaco, el ciclo menstrual, la técnica de medición, las infecciones respiratorias o las bronquiectasias, entre otros.

CONDENSADO DEL AIRE EXHALADO

El condensado de aire exhalado (CAE) es un método no invasivo que permite recoger moléculas volátiles procedentes de las vías respiratorias. Estas moléculas son el resultado de la condensación del vapor de agua producto de la inhalación a través de un sistema de enfriamiento o congelación. Este vapor contiene una mezcla de compuestos volátiles y no volátiles provenientes del fluido del revestimiento epitelial de la vía aérea. A una respiración con volumen corriente se tarda unos 10-15 minutos en recolectar una muestra de 1 a 3 ml. A pesar de que los aspectos metodológicos para la obtención del CAE han sido revisados por la ERS35, su utilidad se centra principalmente en estudios de investigación (para la evolución de biomarcadores representativos del proceso inflamatorio o del estrés oxidativo de las vías aéreas respiratorias) o en el campo epidemiológico.

Dentro de las enfermedades más comunes en las que se ha utilizado la medición del CAE figuran el asma, la rinitis alérgica, la EPOC, la fibrosis quística, las bronquiectasias, la tos crónica, el reflujo gastroesofágico, la fibrosis pulmonar idiopática y la hipertensión pulmonar. En el área del asma, se emplea principalmente en el diagnóstico de asma relacionada con el trabajo y como posible marcador de respuesta al tratamiento de agudizaciones asmáticas.

Existen factores descritos que pueden influir en la recogida de la muestra, y entre ellos están la edad, el sexo, el tabaco, el aire ambiente que el paciente respira en el momento de su recogida, la contaminación con saliva, el patrón ventilatorio y el consumo de alimentos previo a la obtención de la muestra. Dentro de los marcadores inflamatorios más comúnmente medibles con el CAE figuran el pH, marcadores de estrés oxidativo (el 8-isoprostano, el H2O2, aldehídos), el óxido nítrico (NO), prostaglandinas y leucotrienos.

TEMPERATURA DEL AIRE EXHALADO

Diversos estudios realizados en asmáticos plantean la temperatura del aire exhalado (TAE) como un nuevo método no invasivo de la inflamación bronquial del asma36. Sin embargo, otros trabajos publicados discrepan de la posible utilidad de este método36-39. El principio de la TAE se basa en que la inflamación de la mucosa bronquial en los asmáticos ocasiona una vascularización de la misma, que a su vez provoca un aumento del flujo sanguíneo y que se traduce en cambios en la temperatura de la vía aérea.

Dentro de los métodos que se han descrito para medir la TAE se encuentran el incremento de la temperatura del aire exhalado (iTAE), propuesta por Paredi et al.36; la temperatura máxima observada del aire exhalado (TAE pico) y la temperatura meseta en la finalización de una maniobra de exhalación (TAE plateau), propuestas por Piacentini et al.40-42. En el año 2007, el grupo de Popov et al.43 diseñó un equipo para la medición de la TAE plateau del aire exhalado tras respirar a volumen circulante. Este equipo, llamado X-halo, ha sido comercializado por Delmedica (Singapur) y es el que en las últimas publicaciones se utiliza para medir la TAE.

A pesar de las diferentes formas de medir la TAE, todos los estudios descritos hasta el momento han evidenciado diferencias estadísticamente significativas en las mediciones de la TAE entre asmáticos y controles sanos. Sin embargo, no parece existir una correlación entre la TAE plateau y el grado de control o la gravedad de la enfermedad, el grado de obstrucción o el tipo de inflamación bronquial37.

Dentro de las limitaciones de la TAE debe tenerse en cuenta que ninguna de las formas de medición de la misma hasta el momento (la iTAE, la TAE pico, la TAE plateau y la TAE mvc) está estandarizada, y que tampoco existe un equipo comercializado que facilite todos estos valores ni el cálculo posterior en las tres primeras modalidades de medición de la TAE.

DETECCIÓN DE COMPUESTOS ORGÁNICOS VOLÁTILES MEDIANTE LA NARIZ ELECTRÓNICA

La nariz electrónica se basa en la detección de compuestos orgánicos volátiles (COVs) presentes en la fase gaseosa de la respiración humana, los cuales pueden ser detectados por sensores de cromatografía y espectrometría de masas. La nariz electrónica es un dispositivo que contiene varios sensores que, al ser expuestos a partículas volátiles, experimentan cambios específicos en su resistencia eléctrica, cambios que posteriormente se traducen en un patrón o perfil de COVs mediante regresiones logarítmicas. Los patrones de COVs son sustancias químicas compuestas de carbono que tienen la capacidad de convertirse en vapor y contactar con la atmósfera. Se han descrito muchas sustancias químicas sensibles a ser medidas, como el benceno, el isopreno, el formaldehído o el tolueno. Los COVs pueden ser usados como biomarcadores no invasivos de “huellas olfativas” capaces de distinguir enfermedades.

Diversos estudios han demostrado que la nariz electrónica es capaz de discriminar asmáticos de controles sanos44, fumadores de no fumadores, EPOC vs asma45 y el grado de control del asma46; recientemente, además, en un estudio realizado por nuestro grupo, se concluyó que el uso de la nariz electrónica puede discriminar con fiabilidad los diferentes fenotipos inflamatorios bronquiales en pacientes con asma persistente47. Dentro de otras utilidades de la nariz electrónica, se ha observado que el rendimiento diagnóstico del asma aumenta cuando se combina con la FeNO48. Así mismo, se ha descrito su utilidad en el diagnóstico del reflujo gastroesofágico49, del mesotelioma pleural maligno50 y del cáncer de pulmón de célula no pequeña51.

Dentro de las limitaciones hay que mencionar que hasta la fecha no existe una estandarización del método y hay que tener en cuenta aspectos como el tipo de nariz utilizada (por espectrometría de masa, por cromatografía de gases, Cyranose 320), el tipo de análisis de los resultados (validación cruzada, M-distance, redes neuronales) y la validación y reproducibilidad de los resultados en cada una de las narices utilizadas en los diversos estudios publicados. Aun así, los resultados de la nariz electrónica son prometedores y apoyarían el futuro de este dispositivo en un entorno clínico habitual como método no invasivo capaz de discriminar con fiabilidad diversas enfermedades, así como los diferentes fenotipos inflamatorios del asma.

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